Click-iT EdU-555 Cell Proliferation Assay Kit

 

termék neve	A termék azonosítása	modell
Click-iT EdU{-555 cella proliferáció vizsgálat készlet	G1602	100T

 

 

A sejtproliferációs képesség elemzése általános és fontos értékelési módszer az élettudományokban. Meg tudja ítélni bizonyos gének, gyógyszerek stb. hatását az in vitro tenyésztett sejtekre, vagy elemzi a szöveti sejtek növekedési és megújulási képességét különböző körülmények vagy stimuláció mellett. Jelenleg számos módszer létezik a sejtproliferáció kimutatására. Legtöbben a sejtek által termelt metabolikus enzimeket használnak fel a sejtproliferációs aktivitás közvetett értékelésére (például CCK-8 módszer, MTT módszer stb.), de bizonyos gyógyszerek vagy maga a sejt állapota hatással lesz a sejtburjánzásra. az értékelés eredményeit. A sejtproliferáció meghatározására szolgáló DNS-szintézis közvetlen kimutatása a sejtekben a legpontosabb és leghatékonyabb kimutatási módszer. Mindazonáltal mind az eredeti, radioaktívan jelölt nukleozid beépítési módszernek, mind a BrdU-módszer ezt követő továbbfejlesztésének, amely az antitestek kimutatására épül, megvannak a maga korlátai.

Az EdU (5-etinil-2'-dezoxiuridin, 5-etinil-2'-dezoxiuridin) egy acetiléncsoportot tartalmazó timidin-analóg, amelyet állatokba injektálva vagy tenyésztett sejtekben inkubálnak. In vitro ezek a kis molekulák gyorsan diffundálhatnak különböző szervekbe és szövetekbe, beszivároghatnak a sejtekbe, és helyettesíthetik a timidint (T) az újonnan szintetizált DNS-be a sejtproliferáció során. Az EdU molekulában lévő acetiléncsoport reakcióba léphet a fluoreszcensen iF488-cal jelölt azidvegyület próbával, és a rézionok katalízise alatt stabil triazolgyűrűt képezhet, így az újonnan szintetizált DNS a megfelelő fluoreszcens szondával jelölhető. A radioaktívan jelölt nukleozid beépítési módszerrel összehasonlítva az EdU kimutatási módszernek nincsenek korlátozó tényezői, mint például a radioaktív szennyeződés; A BrdU kimutatási módszerhez képest az EdU kimutatási módszer nem igényel DNS-denaturációt vagy antigén-antitest reakciót, ami nagymértékben csökkenti a kísérlet bonyolultságát, valamint időtakarékosabbá, érzékenyebbé, stabilabbá és pontosabbá teszi a kísérletet.

Ez a készlet használható sejtproliferáció kimutatására tenyésztett sejtekben vagy állati szövetekben. A készletben található fluoreszcens szonda vörös fluoreszcens, a maximális gerjesztési hullámhossz 557 nm, a maximális emissziós hullámhossz pedig 570 nm. A burjánzó sejtek jelölése után a sejtmag élénkvörös fluoreszcenciát mutat, a sejtmag pedig a megfelelő hagyományos nukleáris festékkel együtt lesz címkézve (ez a készlet Hoechst 33342 sejtmagfestéket tartalmaz), használhat fluoreszcens mikroszkópot, lézeres konfokális mikroszkópot. és egyéb eszközök a sejtproliferáció közvetlen megfigyelésére; áramlási citometriát is használhat a tenyésztett sejtek fluoreszcencia intenzitásának in vitro kimutatására, majd meghatározhatja a sejtciklust a fluoreszcencia intenzitású DNS replikációs aktivitása alapján a középső S fázisban.

 

 

Szállítás nedves jégen; Az EdU katalitikus reagens (A reagens) és a reakciópuffer 4 fokon tárolható, 12 hónapig érvényes.

 

 

Alkatrészszám	Összetevő	G1602-100T
G1602-1	EdU tárolóoldat (10 mM)	100 μL
G1602-2	Katalitikus reagens (A reagens)	120 μL
G1602-3	iF555 fluoreszcens festék (B reagens)	50 μL
G1602-4	Katalitikus adalék (C reagens)	2×100 mg (por)
G1602-5	Reakciópuffer	20 ml
G1602-6	Hoechst 33342 festőoldat	30 μL
Kézikönyv		Egy példány

 

 

1. szérumot tartalmazó sejttenyésztő táptalaj;

2. Permeabilizációs reagens: 0,2%- 0,5% Triton® X-100 PBS-ben (G1204);

3. Rögzítőszer: 4% paraformaldehid (G1101) vagy más hasonló reagensek;

4. foszfáttal pufferolt sóoldat (PBS);

5. Ultratiszta víz;

6. Állatmodellezés és szövetmetszettel kapcsolatos reagensek (állati szöveti sejtproliferáció kimutatása)

 

 

1. Tenyésztett sejtek in vitro előkezelése:

1.1. Egyenletesen ültesse a sejteket a sejttenyésztő lemezre egy bizonyos sűrűségben (az ültetési sűrűséget olyan tényezők határozzák meg, mint a sejtméret, a növekedési sebesség stb.). Miután a sejtek a falhoz tapadnak, vagy visszatérnek normál állapotba, végezze el a megfelelő gyógyszeres stimulációt és egyéb kezeléseket. (Szuszpenziós sejtek esetében kövesse a szuszpenziós sejtek normál működési módját. Az egész kísérlethez centrifugálást és egyéb lépéseket kell kiegészíteni).

1.2. A katalitikus adalékot (C reagens) kis sebességgel centrifugáltuk, 100 mg-ot vettünk fel és 1 ml ultratiszta víz hozzáadásával feloldottuk, majd kiadagoltuk és -20 fokon tároltuk, a maradék port tartaléknak tartottuk.

2. In vitro sejtes EdU jelölés, rögzítés és permeabilizálás:

2.1. Készítsen 2×EdU inkubációs munkaoldatot: adjon 2 μL EdU tárolóoldatot (10 mM) minden 1 ml komplett sejttenyésztő tápközeghez, ami 20 μM 2×EdU inkubációs munkaoldat, és helyezze az inkubátorba előmelegítésre (ajánlott Az EdU munkakoncentrációja 10 μM az előzetes kísérletekhez);

2.2. A félig változó üzemmódban szívja fel a tenyésztőlemezen lévő eredeti sejttenyésztő tápközeg felét, és adjon hozzá azonos térfogatú előmelegített 2×EdU inkubációs munkaoldatot, és inkubálja egy bizonyos ideig (az inkubáció időtartama általában attól függ a megfelelő sejtek növekedési ciklusán, amely általában a sejtciklus körülbelül 10%-át teszi ki. A többnyire tapadó és gyorsan növekvő sejtek esetében körülbelül 2 órás inkubáció javasolt. Konkrét esetekben igazítani kell a sejtjellemzőkhöz, a kezelés utáni aktuális helyzethez stb. Ha hosszabb inkubációs időre van szükség, az EdU munkakoncentrációja megfelelően csökkenthető rövidebb időre, az EdU koncentráció megfelelő lesz fokozott);

2.3. Az EdU inkubálása után mosson PBS pufferrel 1-2 alkalommal, adjon hozzá fixáló folyadékot, hogy ellepje a sejteket, és rögzítse szobahőmérsékleten 15 percig (ha áramlási citometria szükséges, a megtapadt sejteket meg kell emészteni és újraszuszpendálni e lépés előtt rögzítse, kövesse a szuszpenziós cella feldolgozási módszerét); Mosás 2-3 alkalommal PBS pufferrel, minden alkalommal 3-5 perc;

2.4. Távolítsuk el a PBS-puffert, adjunk hozzá permeabilizáló oldatot, hogy ellepje a sejteket, és inkubáljuk szobahőmérsékleten 15 percig;

2.5. Távolítsa el a permeabilizáló oldatot, mosson 1-2 alkalommal PBS pufferrel, minden alkalommal 3-5 percet. Ezután folytassa a 4. lépéssel.

3. Állatok EdU injekciós modellezése, valamint szövetmetszetek feldolgozása:

3.1. A kísérleti követelményeknek megfelelően egy vagy több EdU injekciót alkalmaznak az állatok modellezésére intraperitoneális injekcióval, intramuszkuláris injekcióval, szubkután injekcióval, farokvéna injekcióval stb. Az EdU dózisának az állat testtömegéhez viszonyított aránya általában 5 mg/kg, a tényleges injekció dózisa a kutatási tartalomtól és az állati körülményektől függ. A készletben található EdU tárolási megoldást főként in vitro sejt EdU jelölésre használják. Ha egy állatot EdU-val kell modelleznie, az EdU reagenst külön is megrendelheti (kat. szám: G5059);

3.2. A hámsejtek, például a vékonybél gyorsan, míg az agysejtek lassan szaporodnak. A gyorsabban növekvő szövetek jelölése általában kevesebb, mint 12 órát vesz igénybe, míg a lassabban növekvő szöveteknél több nap is eltarthat. Az optimális jelölési időt az adott kísérlet alapján határoztuk meg. A bélhámszövet gyors burjánzása miatt az ilyen szövetet javasolták referenciaként a jelöléshez.

3.3. Miután az állatot a meghatározott szabványok szerint leölték, a szükséges szöveteket ki kell venni, és fagyasztott metszeteket vagy paraffin metszeteket készíteni a hagyományos eljárások szerint:

a. Fagyasztott metszeteknél: helyezze vissza a metszeteket szobahőmérsékletre, adjon hozzá megfelelő mennyiségű rögzítőfolyadékot, és rögzítse szobahőmérsékleten 15 percig. Távolítsa el a rögzítőfolyadékot, és mossa le 3-szor PBS pufferrel, egyenként 3-5 percig; távolítsa el a PBS puffert, fedje be a szövetet megfelelő mennyiségű permeabilizáló oldattal, és inkubálja szobahőmérsékleten 10-15 percig; távolítsa el a permeabilizáló oldatot, és mosson PBS pufferrel 1- 2 alkalommal, minden alkalommal 3-5 percet. Ezután folytassa a 4. lépéssel.

b. Paraffinos metszetekhez: Paraffinmentesítse és rehidratálja a metszeteket, majd 5 percig mossuk PBS-sel. Távolítsa el a PBS-puffert, adjon hozzá permeabilizáló oldatot, hogy a sejteket vagy szöveteket ellepje, és inkubálja szobahőmérsékleten 15 percig; Ezután mosson PBS pufferrel 1-2 alkalommal, minden alkalommal 3-5 percig. Ezután folytassa a 4. lépéssel.

4. Edu kattintási reakció:

4.1. Sejt- vagy szövetrögzítés és perforáció során reakcióoldat elkészítése: a reagenseket az alábbi arány szerint keverjük össze, a készítmény térfogata a minták számával arányosan növelhető vagy csökkenthető.

 

Összetevő	Hangerő (cellához)	kötet (a szövettani részhez)
reakciópuffer	935 μL	928 μL
A reagens	10 μL	10 μL
B reagens (iF555 festék)	5 μL	12 μL
C reagens	50 μL	50 μL
teljes kapacitás	1000 μL	1000 μL

 

4.2. Távolítsuk el a PBS puffert a sejtekről vagy metszetekről, adjuk hozzá a reakcióoldatot, óvatosan rázzuk fel, hogy a reakcióoldat minden sejtet vagy szövetet ellepjen, majd inkubáljuk 30 percig szobahőmérsékleten, sötétben;

4.3. Távolítsa el a reakcióoldatot, mosson 2-3-szer PBS pufferrel, minden alkalommal 3-5 percet (ha nincs más speciális követelmény, a fluoreszcencia intenzitása áramlási citometriával, vagy a fluoreszcencia hatás kimutatható egyéb eszközök).

5. Nukleáris folt (opcionális):

5.1. Hígítsa fel a Hoechst 33342 festőoldatot PBS-pufferrel 1:500-1000 arányban, adja a mintához, hogy ellepje a sejteket, és inkubálja 5 percig;

5.2. Távolítsa el a Hoechst 33342 festőoldatot, mosson 2-3 alkalommal PBS pufferrel, minden alkalommal 3-5 percet.

6. Képalkotó és észlelési elemzés:

Használjon fluoreszcens mikroszkópot vagy konfokális mikroszkópot a feldolgozott sejtek vagy szövetmetszet minták kimutatására, és elemezze a proliferáló sejtek arányát. Alternatív megoldásként az in vitro tenyésztett sejteket össze lehet gyűjteni, és a fluoreszcencia intenzitása mérhető áramlási citometriával (ajánlott az EdU-val nem jelölt sejtmintákat negatív kontrollként használni az áramlási citometriás vizsgálathoz, és kiválasztani a megfelelő feszültséget). A fluoreszcencia intenzitásán meghatározható az S-fázis DNS-replikációs aktivitása a sejtciklusban. Az ebben a kitben található if555 fluoreszcens festék (B reagens) megfelel az Ex/Em spektrális jellemzésének: 557 nm/570 nm (piros); A Hoechst 33342 festőoldat megfelel az Ex/Em spektrális jellemzésének: 346 nm/460 nm (kék).

 

 

1. A tenyésztett sejtek esetében a fajlagos EdU koncentráció és az inkubációs idő a mintától és a kutatási céltól függően megfelelően beállítható.

2. Egyes szövetsejtek lassan szaporodnak. A gyenge modellezési hatás elkerülése érdekében referenciamintákként a gyors proliferációjú szövetminták (például bélszövet) kiválasztása javasolt.

3. Ha a háttérszín túl sötét, annak oka lehet az elégtelen mosás, a hosszan tartó fixálás, a kísérletben maradt fixáló stb.

4. A C reagens (EdU katalitikus addíciós reagens) könnyen oxidálható. Próbálja meg elkerülni a tartós levegőnek való kitettséget. Vizes oldatként történő elkészítést követően ajánlatos aliquotban tárolni; A tesztelt, mint például az EdU katalitikus adalék reagens színe enyhén megváltozik, a kattintási reakció katalitikus rendszer továbbra is képes normálisan haladni. ha a C reagens barnának tűnik, az azt jelzi, hogy az alkatrész lejárt, ezért kérjük, dobja ki.

5. Egészsége és biztonsága érdekében, kérjük, viseljen laborköpenyt és kesztyűt működés közben.

 

Csak kutatási célra!

 

 

Népszerű tags: click-it edu{1}} sejtproliferációs vizsgálati készlet, Kína click-it edu-555 sejtproliferációs vizsgálati készlet gyártók, beszállítók, gyár