Calcein AM

 

Termék neve	Macska.Nem.	Spec..
Calcein AM	G1728-0.1ML	0,1 ml

 

 

A Calcein AM (Calcein acetoxymethyl ester) a Calcein alapú acetoximetilészter (AM) csoport bevezetésével növeli a hidrofobicitást, így könnyen áthatol az élő sejtek membránján. Maga a calcein AM egy sejtáteresztő, nem fluoreszcens és hidrofób vegyület, amely a sejtbe jutva a sejtben lévő endogén észterázok hatására hidrolizálódik, hogy az erősen negatív töltésű poláris molekula kalcein keletkezzen, amely nem tud áthatolni a sejtmembránon, és így a cellában megmarad, míg a Calcein (maximális gerjesztési hullámhossz: 494 nm; maximális emisszió hullámhossz: 517 nm) erős zöld fluoreszcenciát bocsáthat ki. Más hasonló próbákkal (pl. BCECF AM és CFDA AM) összehasonlítva a Calcein AM jelenleg az egyik legideálisabb fluoreszcens szonda az élő sejtek festésére, mivel nagyon alacsony citotoxicitása, gyakorlatilag nincs hatással a sejtfunkciókra, például a sejtproliferációra vagy a limfocita kemotaxisra, és alacsony pH-érzékenység.

Az elhalt sejtekben az észteráz hiánya miatt a Calcein AM-t csak az életképesség vizsgálatára és az élő sejtek rövid távú jelölésére használják. A vörös fluoreszcens nukleinsav festék, a propidium-jodid (PI) nem hatol be az élő sejtek sejtmembránján, az elhalt sejtmembrán rendezetlen régióján keresztül jut el a sejtmagba, és beágyazódik a sejt DNS kettős hélixébe, hogy vörös fluoreszcenciát hozzon létre. gerjesztés: 535 nm, emisszió: 617 nm), ezért a PI csak az elhalt sejteket festi meg. A Calcein AM-et gyakran propidium-jodiddal (PI) kombinálva használják élő és elhalt sejtek egyidejű kettős fluoreszcens festésére. Mivel a kalcein és a PI-DNS is gerjeszthető 490 nm-en, az élő és elhalt sejtek egyidejűleg megfigyelhetők fluoreszcens mikroszkóppal. 545 nm-es gerjesztésnél csak az elhalt sejteket lehet megfigyelni.

A Calcein AM a legtöbb emlős sejtben alkalmazható. Kimutatták, hogy a Calcein AM felhasználható egyes növényi sejtekben, például az Arabidopsis gyökérszegély-szerű sejtekben és néhány élesztőben, mint például a Pichia anomala és a Saccharomyces cerevisiae. Egyes paraziták, mint például a Leishmania, a sejtmembrán komponensei miatt nem tudnak bejutni az élő sejtekbe, de a Calcein AM az apoptózis korai szakaszában bejuthat a parazita sejtekbe, így a PI-vel együtt használják a paraziták kimutatására az apoptózis korai szakaszában. A Calcein AM nem alkalmas gombák és baktériumok kezelésére, mert sejtfalaik megakadályozzák a Calcein AM sejtekbe jutását.

A kalcein maga egy fémkomplexképződés indikátora, és a fluoreszcens jel kioltódik, amikor fémionokkal, például Co-val komplexál.²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Fe³⁺, és Mn²⁺fiziológiás pH-n, így a Calcein AM zöld fluoreszcens szondává is válik, amellyel meghatározható a mitokondriális permeabilitás átmeneti pórusa.

Ez a termék, a Calcein AM, nagy tisztaságú, és vízmentes DMSO-ban van feloldva 2 mM koncentrációban. A Calcein AM általánosan használt végső koncentrációja 0.1-5.0 μM. A kívánatosabb eredmény elérése érdekében kérjük, állítsa be megfelelően a Calcein végső koncentrációját a sejtek típusának és a kísérlet aktuális helyzetének megfelelően.

 

 

-20 végzettség tárolásra és szállításra, 12 hónapig érvényes.

 

 

Összetevő	G1728-0.1ML
Calcein AM	0,1 ml
Kézikönyv	1 db

 

 

Calcein AM festő munkaoldatot készítettünk:

Hígítsa fel a terméket megfelelő pufferrel, például szérummentes táptalajjal, HBSS-sel (G4203) vagy PBS-sel (G4202), hogy megfelelő koncentrációban készítsen Calcein AM festő munkaoldatot. 0.1-5.0 µM.

Megjegyzés: A Calcein AM végső koncentrációját ajánlatos megfelelően beállítani a sejttípusnak és a kísérleti valóságnak megfelelően.

 

Eljárások

1. Fluoreszcens mikroszkópos vizsgálat vagy fluoreszcens zimográfia vizsgálat szuszpenziós sejtekhez:

a) A sejteket a kísérleti terv szerint meghatározott kezelések után megszámoltuk. Vegye ki a megfelelő sejteket, és centrifugálja őket 250 × g-vel 5 percig szobahőmérsékleten, dobja ki a felülúszót, és adjon hozzá megfelelő mennyiségű Calcein AM festő munkaoldatot, hogy a sejtsűrűség körülbelül 1 × 10 legyen.⁶/ml.

b) Inkubálja a sejteket 37ºC-on 30-45 percig, az optimális inkubációs idő különböző sejteknél eltérő. Tekintsük a 30 percet a kezdeti inkubációs időnek, és optimalizáljuk az adott kísérleti helyzetnek megfelelően, hogy ideálisabb detektálási eredményeket kapjunk.

c) Az inkubáció végén centrifugálja 250 × g-vel 5 percig, szívja le a felülúszót, és lassan szuszpendálja újra a sejteket 37 °C-ra előmelegített táptalaj hozzáadásával.

d) Ismételje meg a c lépést kétszer vagy többször a megfelelő mosáshoz, hogy eltávolítsa a maradék festőoldatot.

e) Cserélje ki a friss, 37°C-ra előmelegített táptalajt, és inkubálja 37°C-on további 30 percig fénytől távol, hogy az intracelluláris észterázok megfelelően hidrolizálják a Calcein AM-et ahhoz, hogy zöld fluoreszcenciával rendelkező calceint állítsanak elő.

f) A sejteket 250×g-vel 5 percig szobahőmérsékleten centrifugáltuk, a táptalaj nagy részét leszívtuk, majd a sejteket a maradék tápközeggel újraszuszpendáltuk és bekentük, majd fluoreszcens mikroszkóp alatt megfigyeltük, vagy fluoreszcenciával detektáltuk. zimográfia. A Calcein maximális gerjesztési hullámhossza 494 nm, a maximális emisszió A hullámhossz 514 nm. Szükség esetén más fluoreszcens újrafestés is elvégezhető, és az egész folyamatot fényműveléssel kell elkerülni.

 

2. Tapadó sejtek fluoreszcens mikroszkópos vizsgálata vagy fluoreszcens enzimes jelölési vizsgálat:

a) A sejteket Petri-csészékre, többüregű sejttenyésztő lemezekre vagy sejtcsúszókra oltottuk, és a kísérleti tervnek megfelelően meghatározott módon kezeltük.

b) Szívja fel a tenyészoldatot, és mossa át a sejteket 1-2-szer PBS-sel.

c) Adjon hozzá megfelelő mennyiségű Calcein AM festőoldatot, és finoman rázza fel, hogy a festék egyenletesen fedje be az összes sejtet. Általában a 96-lyuklemez térfogata 100 ul/lyuk, a 24-lyuklemez 250 ul/lyuk, a 12-lyuklemez 500 ul/lyuk, és 6- üreges lemez 1 ml üregenként.

d) Inkubálja 37ºC-on 30-45 percig, az optimális inkubációs idő a különböző sejteknél eltérő. Vegyünk 30 percet kezdeti inkubációs időnek, és optimalizáljuk az inkubációs időt a használt sejteknek megfelelően, hogy még ideálisabb festési hatást érjünk el.

e) Az inkubáció végén a táptalajt friss, 37 °C-ra előmelegített táptalajra cseréltük, és 37 °C-on további 30 percig fénytől távol inkubáltuk, hogy az intracelluláris észteráz megfelelően hidrolizálja a Calcein AM-et a zöld fluoreszcens kalcein előállításához. .

f) Szívja le a tenyésztőfolyadékot, öblítse le PBS-sel 2-3-szer, majd adja hozzá a szérummentes sejttenyésztő folyadékot, amely fluoreszcens mikroszkóp alatt megfigyelhető, vagy fluoreszcens enzimmarkerrel detektálható. A kalcein maximális gerjesztési hullámhossza 494 nm, maximális emissziós hullámhossza 514 nm, és kívánság szerint tovább festhető más fluoreszcensekkel, az egész folyamatot fénytől távol tartva.

 

3. Áramlási citometriai vizsgálat:

a) A tapadó sejtek tripszin emésztése után szuszpendálja újra a sejteket tápközegben, szuszpendálja a sejteket közvetlen felhasználásra, számolja meg, centrifugálja a megfelelő mennyiségű sejtet 250×g-vel 5 percig szobahőmérsékleten, dobja ki a felülúszót, és adjon hozzá megfelelő térfogatú Calcein AM festő munkaoldatot úgy, hogy a sejtek egysejtű szuszpenziót képezzenek, és a sejtek sűrűsége körülbelül 1 × 106 /ml legyen. 1 ml térfogatú mintánként. MEGJEGYZÉS: A sejtekből csak puffermintát kell készíteni az áramlási citometriai vizsgálat negatív kontrolljaként való felhasználásához. negatív kontroll az áramlási citometriás vizsgálathoz, és kívánatos, hogy ez a puffer ugyanaz legyen, mint a Calcein AM festő munkaoldat elkészítéséhez használt puffer.

b) Inkubálja 30 percig 37 °C-on fénytől távol.

c) Az inkubáció befejezése után a sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze 250 x g-vel 5 percig szobahőmérsékleten. Adjunk hozzá 1 ml puffert mintánként, óvatosan szuszpendáljuk újra, és gyűjtsük össze a sejteket szobahőmérsékleten 250×g-vel 5 percig végzett centrifugálással. Megjegyzés: Ez a lépés eltávolítja a felesleges festéket és reagenseket, amelyek fluoreszcens kioltást okozhatnak.

d) Szuszpendálja újra a sejteket 400 µl pufferrel. Szükség esetén további festés is elvégezhető. Vegye figyelembe, hogy az egész folyamatot fénytől távol kell végezni. A festés után a mintákat jégre helyezzük, és 1 órán belül áramlási citometriával detektálható és elemezhető.

e) Vegye figyelembe, hogy csak puffert tartalmazó és festetlen sejtmintákat használtunk az áramlási citométer negatív kontroll beállításához. A kalcein maximális gerjesztési hullámhossza 494 nm, maximális emissziós hullámhossza pedig 514 nm.

 

 

1. Minden fluoreszcens festéknek vannak kioltási problémái, és ügyelni kell arra, hogy lehetőleg kerüljük a fényt, hogy lelassítsuk a fluoreszcencia kioltását.

2. A Calcein AM nagyon érzékeny a páratartalomra és hajlamos lebomlani nedves környezetben, ezért a Calcein AM oldatot minden egyes kihúzás után szorosan le kell zárni a kupakkal. Tárolása külön zárt csomagolásban javasolt az egyszeri adagolásnak megfelelően. Ne használjon víztartalmú pipettahegyeket.

3. Mivel a Calcein AM nem stabil vizes oldatokban, például PBS-ben, a festő munkaoldatot most kell elkészíteni és felhasználni.

4. A táptalajban lévő szérum és fenolvörös hatással van a Calcein AM festődésre, ezért ajánlatos a sejteket alaposan megmosni a Calcein AM munkaoldat hozzáadása előtt.

5. Az egyenletes fluoreszcenciájú calcein AM jelölt sejtek jó választás a sejtkövetéshez és általános citoplazmatikus festéshez, azonban nem kötődik semmihez és néhány órán belül aktívan kivonható a sejtből, illetve a kalcein visszatartása az élő sejtekben a sejttípus és a tenyésztési körülmények sajátosságaitól függ.

6. A Calcein AM festést nem követheti aldehid rögzítés, különben a calcein elvész a rögzítés során. Ezenkívül a plazmamembrán bármilyen megzavarása (pl. vízkőoldó szerek vagy tripszin kezelés) festékszivárgáshoz vezet a sejtekből.

7. Ha a Calcein AM nehezen jut be a sejtekbe, felületaktív anyag, például Pluronic F127 használható. A Calcein AM 1/10 koncentrációjú oldata is használható táptalaj helyett.

8. Ezt a terméket tudományos kutatásban csak szakemberek használhatják, és nem használható diagnosztikai eljárásokra vagy kezelésre, élelmiszerre vagy gyógyszerre, illetve nem tárolható szokásos lakóhelyen.

9. Biztonsága és egészsége érdekében viseljen laborköpenyt és eldobható kesztyűt.

 

Csak kutatási célra!

 

 

Népszerű tags: calcein am, Kína calcein am gyártók, beszállítók, gyár