SweMagrose IDA-Co mágneses agaróz gyöngyök a His-Tag fehérje tisztításához

 

Termék neve	Macska. Nem.	Spec.
SweMagrose IDA-Co mágneses agaróz gyöngyök a His-Tag fehérje tisztításához	G3655-1ML	1 ml
	G3655-5ML	5 ml

 

 

Ez a termék IDA-val módosított agaróz mágneses gyöngyökből és kelátképző nikkelionokból áll. Centrifugális szűrés nélkül képes hatékonyan és gyorsan megtisztítani a biológiai mintákban található hisztidin-címkézett fehérjéket. A művelet egyszerű és alkalmas a baktériumok, élesztőgombák és sejtek felülúszójában vagy sejtjeiben expresszált oldható hisztidin-tag fehérjék tisztítására. Kombinálható nagy áteresztőképességű fehérjetisztító berendezéssel is a fehérje szűréséhez és elválasztásához.

A Co2+ 4 liganduma és kevésbé nem specifikus adszorpciója, a Ni2+ 6 ligandummal és erős fehérjekötő képességgel rendelkezik. Több célfehérjéhez választhatja a többi SweMagrose IDA-Ni mágneses agaróz gyöngyünket is. -Tag Protein Purification (G3654).

 

 

Hajó nedves jéggel; 4 fokon tárolandó, 12 hónapig érvényes.

 

 

Alkatrészszám	Összetevő	G3655-1ML	G3655-5ML
G3655	SweMagrose IDA-Co mágneses agaróz gyöngyök a His-Tag fehérje tisztításához	1 ml	5 ml
Kézikönyv		1 db

 

 

1. A különféle reagensek konfigurációja az alábbiak szerint írható le. A felhasználók a reagensek helyzetének megfelelően választhatják ki a megfelelő mennyiségű mágneses gyöngyöt és puffer formulát.

Összetevő	Kötet
10 × PBS (200 mM nátrium-foszfát, pH 7,4)	50 ml
10x imidazol puffer (200 mM nátrium-foszfát, 5 M imidazol, pH 7,4)	50 ml
Kobalteltávolító (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 mM EDTA, pH 7,4)	10 ml
Lúgos mosóoldat (0,5 M NaOH, 2 M NaCl)	10 ml
href="javascript:;" Kobalt-szulfát (100 mM CoSO4)	15 ml
Tartósító oldat (20%-os etanol)	50 ml

 

2. Puffer konfiguráció

A célfehérje fémion kelátképző gyöngyökkel való kötési teljesítménye közvetlenül befolyásolja a célfehérje tisztítási hatékonyságát, és a különböző pufferek bizonyos mértékig befolyásolják a célfehérje kinyerését és tisztaságát is. Ezért a nagy léptékű fehérjetisztítás előtt a felhasználóknak meg kell tervezniük saját kísérleteiket a célfehérje számára megfelelő pufferek szűrésére, beleértve a kötőpuffert, a mosópuffert és az elúciós puffert. Az alább bemutatott pufferrendszer a legtöbb hisztidin-tag fehérje tisztítására alkalmas. a felhasználók tájékoztatására.:

Kötő puffer: 20 mM nátrium-foszfát, 500 mM NaCl, 5-50 mM imidazol, pH 7,4

Mosópuffer: 20 mM nátrium-foszfát, 500 mM NaCl, 50-100 mM imidazol, pH 7,4

Elúciós puffer: 20 mM nátrium-foszfát, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 7,4

3. Mintakezelés

a) E. coli, élesztő és egyéb intracellulárisan expresszált fehérjék: adjunk hozzá 5-10 ml kötőpuffert grammonként, adjunk hozzá proteáz inhibitort (pl. PMSF 1 mM végső koncentrációban), szuszpendáljuk újra a sejteket, és ultrahanggal lizáljuk sejteket jégfürdőben, azaz a nyersfehérje mintát. Ha a minta túl viszkózus, szükség szerint megfelelő mennyiségű nukleázt adunk a nyers mintához, és 30 percre jégre helyezzük a nukleinsavak lebontására. Alternatív megoldásként a fehérjeminta szükség szerint centrifugálható.

b) Extracellulárisan expresszált fehérje: A nyersfehérje mintát akkor kaptuk, amikor az extracelluláris expressziós felülúszót azonos mennyiségű kötőpufferrel hígítottuk.

c) Intracellulárisan expresszált fehérjék állati sejtekben: Vegyünk megfelelő mennyiségű állati sejtet, mossuk le egyszer megfelelő mennyiségű PBS-sel (önálló), dobjuk ki a felülúszót, szuszpendáljuk újra megfelelő mennyiségű kötőpufferrel, amely 1% (v/v) Triton X-et tartalmaz. -100 vagy 1% (v/v) NP-40, adjon hozzá proteázgátlót (pl. PMSF-et 1 mM végső koncentrációban), és tegye jégen 10 percig, azaz nyersfehérje minta.

4. A célfehérje kötődése mágneses gyöngyökhöz:

a) Szuszpendáljunk 2 g nedves tömeget az organizmusokból 10 ml kötőpufferrel, majd fragmentálás és lízis után a cél nyersfehérje mintáját egy előkezelt mágneses gyöngyöket tartalmazó centrifugacsőbe adjuk, és a csövet egy vortex keverővel és 15 másodpercig rázzuk. A megcélzott nyersfehérje-mintát ezután egy előkezelt mágneses gyöngyökkel ellátott centrifugacsőbe adjuk.

b) Helyezze a centrifugacsövet egy forgó keverőre 20-30 percre szobahőmérsékleten (ha szükséges, forgathatja és keverheti 1 órán át alacsony, 2-8 fokos hőmérsékleten, hogy megakadályozza a célfehérje lebomlását) .

c) Helyezze a centrifugacsövet a mágneses szeparátorra az elválasztáshoz, a felülúszót vigye át egy új centrifugacsőbe a későbbi teszteléshez, és vegye ki a centrifugacsövet a mágneses szeparátorból a következő mosási lépésekhez.

5. Mágnesgyöngy mosása:

a) Adjon 10 ml mosópuffert a mágneses gyöngyöket tartalmazó centrifugacsőhöz, óvatosan forgassa el a csövet többször a gyöngyök újraszuszpendálásához, válassza el őket mágnesesen, majd vigye át a mosóoldatot egy új centrifugacsőbe mintavétel céljából. Ismételje meg ezt az eljárást egyszer.

b) Adjon 10 ml mosópuffert a mágneses gyöngyöket tartalmazó centrifugacsőhöz a gyöngyök újraszuszpendálásához, vigye át a gyöngyszuszpenziót egy új centrifugacsőbe (hogy elkerülje a célfehérjék szennyeződését a nem specifikusan adszorbeált fehérjékkel az eredeti centrifugacső falán ), mágnesesen válasszuk el, és pipettázzuk a felülúszót a Wash Buffer Collection Tube.

6. Célfehérje eluálás

a) A felhasználók az elúciós térfogat szükség szerinti változtatásával módosíthatják a célfehérje koncentrációját. Adjon hozzá 2-10 ml elúciós puffert, óvatosan fordítsa el többször a csövet a gyöngyök felfüggesztéséhez, mágnesesen válassza el a gyöngyöket, és gyűjtse össze az eluátumot egy új centrifugacsőbe, amely a tisztított célfehérje minta.

a) Ha szükséges, ismételje meg a fenti lépéseket egyszer, hogy a mintát egy új centrifugacsőbe gyűjtse, és ellenőrizze, hogy a célfehérje teljesen eluálódott-e.

b) Határozza meg a célfehérjét SDS-PAGE vagy Western-blot segítségével. Ha meg kell mérnie a fehérjekoncentrációt, használhatja az Elution Buffert a koncentráció nullázására, vagy dialízist vagy ultraszűrést alkalmazhat az imidazol eltávolítására, majd megmérheti a koncentrációt.

7. Mágneses gyöngy utófeldolgozás

a) Adjon 5 ml eluációs puffert a mágneses gyöngyöket tartalmazó centrifugacsőhöz, forgassa fel és le többször a csövet a gyöngyök felfüggesztéséhez, válassza el őket mágnesesen, és távolítsa el a felülúszót.

b) Ismételje meg kétszer a fenti lépéseket.

c) Adjon hozzá 5 ml ddH O-t a mágneses gyöngyöket tartalmazó centrifugacsőhöz, forgassa a csövet többször fel-le a gyöngyök felfüggesztéséhez, válassza el őket mágnesesen és távolítsa el a felülúszót.

d) Ismételje meg kétszer a fenti lépéseket.

e) Adja hozzá a tartósítóoldatot a mágneses gyöngyökhöz úgy, hogy az össztérfogat 5 ml legyen, tárolja 2-30 fokon (hosszú távú tárolás esetén helyezze 2-8 fokra), és felhasználható ugyanazon fehérje következő tisztítása.

8. Mágneses gyöngy regeneráció

A mágneses gyöngyök 3 vagy több alkalommal történő folyamatos használata esetén a célfehérjékhez való kötődés képessége jelentősen csökkenhet, ezért javasolt a mágneses gyöngyök regenerálási folyamatának végrehajtása. Vegyünk 5 ml 10%-os (v/v) mágneses gyöngy szuszpenziót példaként a mágneses gyöngy regenerálási műveletének részletes bemutatására.

a) A mágneses gyöngyszuszpenziót mágnesesen választottuk el, távolítsuk el a felülúszót, és vegyük ki a centrifugacsövet a mágneses szeparátorból, adjunk 5 ml ddH2O-t a centrifugacsőhöz, és a centrifugacsövet többször forgassuk fel és le a mágneses gyöngyök újraszuszpendálásához. , mágnesesen elválasztjuk és eltávolítjuk a felülúszót.

b) Adjunk hozzá 5 ml kobalteltávolítót, forgassuk fel és le a centrifugacsövet többször a mágneses gyöngyök újraszuszpendálásához, forgassuk és keverjük 5 percig szobahőmérsékleten, válasszuk el mágnesesen és távolítsuk el a felülúszót. Ismételje meg ezt a lépést egyszer.

c) Adjon 5 ml ddH2O-t a mágneses gyöngyöket tartalmazó centrifugacsőhöz, forgassa fel és le a csövet többször a gyöngyök felfüggesztéséhez, válassza el őket mágnesesen és távolítsa el a felülúszót.

d) Lúgos kezelés (opcionális lépés): adjunk hozzá 5 ml lúgos mosópuffert, forgassuk fel és le a centrifugacsövet többször a gyöngyök újraszuszpendálásához, forgassuk és keverjük 5 percig szobahőmérsékleten, válasszuk el mágnessel és távolítsuk el a felülúszót. Adjon hozzá 5 ml ddH2O-t, forgassa fel és le a centrifugacsövet többször a gyöngyök reszuszpendálásához, válassza el mágnesesen és távolítsa el a felülúszót. Ismételje meg a ddH2O mosási lépést 3-5 alkalommal, amíg a mosóoldat semleges lesz.

e) Adjunk hozzá 5 ml nikkel-kloridot, forgassuk fel és le a centrifugacsövet többször a gyöngyök újraszuszpendálásához, forgassuk és keverjük 20 percig szobahőmérsékleten, válasszuk el mágnesesen és távolítsuk el a felülúszót.

f) Adjunk hozzá 5 ml ddH2O-t, és forgassuk fel és le a centrifugacsövet többször a gyöngyök reszuszpendálásához, mágnesesen válasszuk el és távolítsuk el a felülúszót. Ismételje meg ezt a lépést 4-szer.

g) Adja hozzá a tartósítóoldatot a mágneses gyöngyökhöz úgy, hogy a teljes térfogat 5 ml legyen, és tárolja 2-30 fokon (hosszú távú tárolás esetén 2-8 fokon).

 

 

1. Ezt a terméket 20%-os etanolban tárolják, és használat előtt ki kell cserélni.

2. Ne fagyassza le vagy szárítsa meg a gyöngyöket, mert ez befolyásolhatja a végső felhasználást.

3. Használja hozzáillő mágneses kerettel.

 

Csak kutatási célra. Diagnosztikai vagy terápiás eljárásokhoz nem használható!

 

 

Népszerű tags: swemagrose ida-co mágneses agaróz gyöngyök his-tag fehérjetisztításhoz, Kína swemagrose ida-co mágneses agaróz gyöngyök his-tag fehérjetisztításhoz gyártók, beszállítók, gyár számára