TSAPLus fluoreszcens kettős festőkészlet (zöld IF488+ piros IF594)

Termék neve	Macska. Nem.	Spec.
TSAPLus fluoreszcens kettős festőkészlet (Zöld iF488+ Piros iF594)	G1259-50T	50 T
	G1259-100T	100T

 

 

 

Ennek a terméknek a TSAPLus fluoreszcens kettős festőkészlete (IF488+ Red iF594) alkalmas paraffin metszetek kettős immunfluoreszcens festésére, különösen az ugyanabból a forrásból származó elsődleges antitestek kettős fluoreszcens immunjelölésére, valamint az antitestek kettős fluoreszcens immunjelölésére. különböző forrásokból. A fő elv a Tyramide jelerősítésen (TSA) alapul, a továbbiakban: TSA technológia. A TSA technológia fő elve a Tyramide peroxidáz reakciójának felhasználása (vagyis a fluoreszcensen jelölt tiramidsó kovalens kötési helyet képez a HRP katalizált H2O2 alatt) nagyszámú enzimreakció generálására. A termék a környező fehérjemaradékokhoz kötődik (beleértve a triptofán-, hisztidin- és tirozin-maradékokat), és nagy mennyiségű fluoreszcein lerakódást képez az antigén-antitest kötőhelyen, lehetővé téve a jelerősítést. Többszörös fluoreszcens festés is elérhető többszöri ismétlődő immunjelöléssel különböző fluoreszcens tiraminokkal. Összehasonlítva a G1235-tel, cégünk másik TSA fluoreszcens kettős festőkészletével, ez a készlet a FITC-Tyramidot és a CY{7}}Tiramidot iF488-Tiramiddal és iF594-Tiramiddal helyettesíti erősebb és stabilabb fluoreszcenciával. jeleket, amelyek a G1235 továbbfejlesztett változatai.

 

 

 

Fluoreszcens festék típusa	Ex/nm	Em/nm
DAPI	359	457
iF440-Tiramid	434	480
iF488-Tiramid	491	516
iF546-Tiramid	541	557
iF555-Tiramid	557	570
iF594-Tiramid	588	604
iF647-Tiramid	656	670
iF700-Tiramid	690	713
iF750-Tiramid	757	779

 

 

 

A készlet minden komponensét a szükséges feltételeknek megfelelően tároltuk, és nedves jégcsomagokban szállították. 12 hónapig érvényes.

 

 

 

Alkatrészszám	Összetevő		G1259-50T	G1259-100T	Tárolás
G1259-1	iF488-Tiramid		25 μL	2×25 μL	-20 fok
G1259-2	iF594-Tiramid		25 μL	2×25 μL	-20 fok
G1259-3	Tiramid hígítószer		100 ml	2×100 ml	4 fok
G1259-4	DAPI (használatra kész)		10 ml	20 ml	4 fok
G1259-5	Szövet autofluoreszcens kioltó		10 ml	20 ml	Szobahőmérséklet
G1259-6	Anti-fluoreszcencia kioltó		5 ml	10 ml	-20 fok
Termék kézikönyv			1 db

 

 

 

Felkészülés a kísérlet előtt:

1. Készítsen elő 0.01 mol/L PBS-puffert (pH7.0-7.4, G4202 vagy G0002 ajánlott), 3% H2O2 és 0,3% H2O2;

2. Primer antitest és megfelelő HRP-vel jelölt másodlagos antitest, antigénjavító oldat készítése (válasszon megfelelő antigénjavító oldatot az antitest és a szövet típusa szerint);

3. Az adagolás szerint készítsen TSA festő munkaoldatot az alábbi táblázatban szereplő arányok szerint.

TSA festő munkaoldat	Reagens elem	Kötet
TSA-488 festőoldat	Tiramid hígítószer	1 ml
	0.3% H2O2	10 μL
	iF488-Tiramid	2 μL
TSA-594 festőoldat	Tiramid hígítószer	1 ml
	0.3% H2O2	10 μL
	iF594-Tiramid	2 μL

Megjegyzés: Miután a fluoreszcens tiramid megolvadt, a centrifugát rövid ideig centrifugálják, majd a tiszta szívófejet kifújják és összekeverik. A TSA festőoldatot ajánlott most elkészíteni és felhasználni. 4 fokon, sötétben kell tárolni, és 24 órán belül hatásos.

Lépések:

Példaként szövetmetszeteket véve a következő kísérleti lépésekben használt kísérleti víz tiszta víz volt:

1. Viaszmentesített szövetmetszetek vízre;

2. Antigénjavítás: A felhasznált elsődleges antitestnek és a minta típusának megfelelően megfelelő módszereket alkalmaztunk a szövetmetszetek antigénjének javítására;

3. Mossa a szövetet PBS-sel háromszor, minden alkalommal 5 percig, majd rajzoljon körjeleket a szövetre IHC tollal;

4. Az endogén peroxidáz inaktiválása: 3% H2O2-t adtunk a metszetekhez, hogy elfedje a szövetet, és szobahőmérsékleten, sötétben inkubáljuk 25 percig, hogy blokkoljuk az endogén peroxidázt és csökkentsük a nem specifikus háttérfestődést. Mossuk PBS-sel háromszor, minden alkalommal 5 percig;

5. Lezárás: Miután a metszeteket kissé megszárítottuk, 3% BSA-t vagy szérumot adtunk a szövethez, hogy blokkoljuk 30 percig. A lezáró reagenst az elsődleges és a másodlagos antitest fajtája szerint határoztuk meg.

6. Primer antitest inkubáció: Hígítsa fel az elsődleges antitestet a megfelelő koncentrációra PBS-sel (vagy más antitest hígítóval). Óvatosan távolítsa el a folyadékot a metszetből, adjuk hozzá a hígított primer antitestet, hogy befedje a szövetet, és helyezze a metszetet laposan egy vizes dobozba, és inkubálja egy éjszakán át 4 °C-on. Mossuk PBS-sel háromszor, minden alkalommal 5 percig;

7. HRP másodlagos antitest inkubálása: Hígítsa a másodlagos antitestet megfelelő koncentrációra PBS-sel (vagy más antitest-hígítóval), adja hozzá a másodlagos antitestet a szövethez, és inkubálja szobahőmérsékleten 50 percig. Mossuk PBS-sel háromszor, minden alkalommal 5 percig;

8. Adjon hozzá 50-100 μL TSA-488 festő munkaoldatot a szövethez, hogy biztosítsa a szövet teljes befedését, és inkubálja szobahőmérsékleten 10 percig sötétben. Mossuk PBS-sel háromszor, minden alkalommal 5 percig;

9. Mikrohullámú kezelés: A szövetmetszeteket antigénjavító oldattal (a szövet típusának és antitestének megfelelően kiválasztott megfelelő antigénjavító oldat) töltött javítódobozba helyeztük mikrohullámú melegítéssel a megkötött primer és másodlagos antitestek eltávolítására. (Fűtési hőmérséklet és idő: melegítés 95 fokra vagy magasabbra, tartsa 15 percig.) Ebben a lépésben akadályozza meg a folyadék túlzott elpárolgását, ami száraz pelyheket eredményez.

10. Ismételje meg a 6. lépést a második elsődleges antitest inkubálásához: Hígítsa a második antitestet (elsődleges antitest) a megfelelő koncentrációra PBS-sel (vagy más antitest-hígítóval). Finoman rázza le a folyadékot a metszetről, csepegtesse le a hígított antitestet, hogy befedje a szövetet, és tegye a metszetet egy vizes dobozba, és inkubálja egy éjszakán át 4 °C-on. Mossa le PBS-sel háromszor, minden alkalommal 5 percig;

11. Ismételje meg a 7. lépést a megfelelő HRP másodlagos antitest inkubálásához: hígítsa a másodlagos antitestet megfelelő koncentrációra PBS-sel (vagy más antitest-hígítóval), adja hozzá a másodlagos antitestet a szövethez, és inkubálja szobahőmérsékleten 50 percig. Mossuk PBS-sel háromszor, minden alkalommal 5 percig;

12. Adjon hozzá 50-100 μL TSA-594 festőoldatot a szövethez, hogy biztosítsa a szövet teljes befedését, és inkubálja szobahőmérsékleten 10 percig sötétben. Mossuk PBS-sel háromszor, minden alkalommal 5 percig;

13. Nukleáris ellenfestés DAPI: Miután a metszeteket kissé megszárítottuk, DAPI (ready-to-use) festőoldatot csepegtettünk a szövetekhez, és 10 percig szobahőmérsékleten, sötétben inkubáltuk. Mossuk PBS-sel háromszor, minden alkalommal 5 percig;

14. Szöveti autofluoreszcenciás kioltás (opcionális): Adjunk a szövethez szöveti autofluoreszcenciás kioltó szert (szudánfekete), inkubáljuk szobahőmérsékleten 5 percig, öblítsük le folyó vízzel 3 percig;

15. Lezárás és mikroszkópos vizsgálat: Miután a metszetek kissé megszáradtak, csepegtesse le a fluoreszcenciával oltott tömítőanyagot a szeletek lezárásához. A képek megfigyelésére és gyűjtésére fluoreszcens mikroszkópot vagy lézeres konfokális mikroszkópot használtak. A szeleteket 4 C fokon, fénytől védett dobozban 15 napig tárolhatjuk.

 

 

 

1. A fluoreszcens másodlagos antitesttel összehasonlítva a TSA kit nagyobb érzékenységgel és erősebb jellel rendelkezik. Ezért az elsődleges antitest koncentrációját csökkenteni kell, és az antitest kézikönyvben javasolt hígítást 5-10-szeresére kell növelni, hogy csökkentse a nem specifikus kötődés okozta háttérfluoreszcenciát. A legjobb hatás elérése érdekében ajánlatos beállítani az elsődleges antitest gradiens koncentrációját.

2. Ha a háttér fluoreszcencia erős, adjon hozzá szöveti autofluoreszcencia kioltó lépést.

3. A fluoreszcens Tyramide ajánlott hígítási aránya 1:500, és a hígítási arány a kísérleti eredményeknek megfelelően állítható (beállítási tartomány: 1:200-1:1000).

4. Többszörös fluoreszcens jelöléshez ajánlott először a poliklonális antitestet, majd a monoklonális antitestet inkubálni; először a nagy mennyiségben előforduló célfehérjének megfelelő antitestet, majd a kis mennyiségben előforduló célfehérjének megfelelő antitestet inkubáltuk.

 

 

Csak kutatási célra!