2 × Fast SYBR Green QPCR Master Mix (alacsony ROX)

 

Termék neve	Macska. Nem.	Spec.
2× Fast SYBR Green qPCR Master Mix (alacsony ROX)	G3324-01	1 ml
	G3324-05	5×1 ml
	G3324-15	15×1 ml

 

 

A 2× Fast SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) egy speciális 2×-es premix a qPCR reakcióhoz SYBR Green I kiméra fluoreszcencia módszerrel, amely a primerek és a DNS templátok kivételével az összes qPCR komponenst tartalmazza, ami csökkentheti a műveleti lépéseket, lerövidítheti az időt. minták hozzáadásával, és csökkenti a szennyeződés esélyét. A központi komponens a géntechnológiával módosított hot-start Taq DNS polimeráz, amely hatékonyan zárja le a DNS polimeráz aktivitást, és alacsony hőmérsékleten megakadályozza a nem specifikus amplifikációt azáltal, hogy hatékonyan kombinálja a monoklonális antitestet és a Taq DNS polimerázt, számos előnnyel, mint például a nagy specificitás és nagy érzékenység, és qPCR-re optimalizált reakciópufferrel van összekapcsolva. Nagyon alkalmas nagy specificitású és nagy érzékenységű qPCR reakcióhoz. Ez a termék egy 2× előkevert reagens, amely a SYBR Green I optimális koncentrációját tartalmazza a qPCR reakcióhoz, amely széles kvantitatív régióban jó standard görbét kaphat, a célgének pontos mennyiségi meghatározását, jó reprodukálhatóságot, nagy megbízhatóságot és a leggyorsabb qPCR reakciót 30 perc alatt teljesíthető.

 

 

Nedves jéggel szállítjuk. Tárolás -20 fokon világítás nélkül, 12 hónapig érvényes. Kerülje a fagyasztás-olvadási ciklusokat. Felolvasztás után 4 fokon stabilan tárolható egy hónapig fény nélkül.

 

 

Összetevő	G3324-01	G3324-05	G3324-15
2×Fast SYBR Green qPCR Master Mix (alacsony ROX)	1 ml	5×1 ml	15×1 ml
Kézikönyv	Egy példány

 

 

Mielőtt elkezdené

1. Valós idejű PCR amplifikációs műszer;

2. Speciális reakciócső vagy reakciólap kísérlethez;

3. PCR primerek (referencia primer tervezési elvek);

4. Mikropipetta és autoklávozó hegyek;

 

 

1. Javasolt PCR reakciórendszer

Összetevő	20 μL rxn	50 μL rxn	Végső koncentráció
2×Fast SYBR Green qPCR Master Mix (alacsony ROX)	10 μL	25 μL	1×
Előre Primer (10 μM)a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Fordított primer (10 μM)a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Sablonb	Változó	Változó	igény szerint
Nukleázmentes víz	Adjunk hozzá 20 μL-hez	Adjuk hozzá 50 μl-hez

a. Általában jó amplifikációs hatás érhető el {{0}},2 μM végső koncentrációval. Ha a reakció gyenge, a primer koncentrációja a 0.2-1,0 μM tartományban állítható.

b. A hozzáadott templát mennyisége a célgén másolatainak számától függően változik, és a templát hozzáadásának megfelelő mennyiségét gradiens hígítással vizsgálják. A 20 μl-es reakciórendszerben a templát DNS legjobb hozzáadott mennyisége 100 ng-nál kisebb volt. Ha az RT-PCR reakció cDNS-ét (RT reakcióoldatot) használtuk templátként, a hozzáadott mennyiség nem haladhatja meg a végső qPCR térfogat 10%-át.

2. PCR reakció menete (a műszerek szerint állítható):

3.

Színpad	Lépés	Ciklusok száma	Hőmérséklet	Idő
1. szakasz	Predegeneráció	1	95 fok	30 seca
2. szakasz	Degeneráció	40	95 fok	3-10 mp
	lágyítás-hosszabbítás		60 fok	10-30 mp
3. szakasz	olvadási görbe	1	A műszer alapértelmezett beállításai

A megfelelő márka fluoreszcens kvantitatív PCR műszerének gyors eljárása javasolt előnyben részesíteni, amely kompatibilis a standard amplifikációs eljárással. A gyorseljárás a legtöbb génre alkalmas, a standard eljárás pedig néhány bonyolult másodlagos szerkezetű gén esetében kipróbálható.

a: A genom templát 2-3 perccel meghosszabbíthatja a degeneráció előtti időt;

b: Ciklus szakasz: a standard eljárás denaturálási ideje 10 mp. Ha az amplifikált fragmentum 200 bp-nál kisebb, a gyors eljárás legrövidebb lehetősége 3 másodperc.

c: Ciklus szakasz: a standard eljárás lágyítási/nyújtási ideje van kiválasztva 30 másodpercre; Ha az amplifikált fragmens 200 bp-nál kisebb, a legrövidebb eljárás 10 másodperces lehet. 200 bp felett az ajánlott választás 30 mp; A fluoreszcencia jelek gyűjtéséhez állítsa be a kísérleti eljárást a műszer használati útmutatója szerint.

 

 

1. Használat előtt óvatosan keverje fel fejjel lefelé. Ne kavargassa és ne rázza meg a buborékok elkerülése érdekében. Használat előtt alaposan keverje össze a reagenseket.

2. A reakcióoldat elkészítésekor a reagenseket jégre kell helyezni.

3. A termék SYBR Green fluoreszcens festéket tartalmaz, ezért a PCR reakcióoldat elkészítésekor kerülni kell az erős fényt.

4. Kérjük, használjon új eldobható fejet a reakcióoldat elkészítéséhez és csomagolásához, hogy elkerülje a minták közötti szennyeződést.

5. Kerülje a Master Mix ismételt fagyasztását-olvasztását, és próbálja meg a felengedés után egy hónapon belül felhasználni.

 

 

PCR gép márkája	G3323 (Nincs ROX)	G3324 (alacsony ROX)	G3325 (Magas ROX)
ABI Thermo élettartam	PikoRealTM Kerékpáros	7500/7500 gyors, ViiA 7™ QuantStudio™ sorozat	5700/7000/7300/7700/7900/ 7900HT/7900 HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™
Stratagene		Mx3000P®/3005P™/4000™
Bio-Rad	Minden sorozat
Eppendorf	Realplex 2s, Mastercycler®ep realplex
IIIumina	Eco QPCR
Cefeida	SmartCycler®
Qiagen Corbett	Rotor-Gene® sorozat
Roche	LightCycler™ sorozat
Takara	Thermal Cycler Dice sorozat
Analytikjena	qTOWER sorozat
qTOWER	LineGene sorozat

 

 

1. Az amplifikációs szorzat hossza javasolt, hogy 80-300 bp között legyen;

2. Alapozó hossza: 18-25 bp;

3. A primerekben a bázis G+C tartalma 40%-60% között legyen;

4. A forward primerek és a fordított primerek közötti Tm-érték különbség kisebb, mint 2 fok, és a 58-62 fok közötti Tm-érték a legjobb;

5. Az alapeloszlás véletlenszerűsége;

6. A primerek jobb, ha nem tartalmaznak önkomplementer szekvenciákat, különben másodlagos hajtűszerkezetet alkotnak;

7. Két primer között legfeljebb 4 komplementer vagy homológ bázis lehet, különben primer dimer képződik, különösen a 3' végén komplementer átfedés;

8. A primer 3' terminális bázisa G vagy C lehet;

9. Az NCBI összehasonlítási eredményeiben nem találtunk más nem specifikus terméket.

 

 

Probléma leírása	Lehetséges okok	Megoldások
A reakció végén nem jelent meg amplifikációs görbe, vagy túl későn jelent meg a CT érték	A sablonkoncentráció túl alacsony	Ismételje meg a kísérletet, hogy csökkentse a templát hígítási többszörösét, és kezdje a legmagasabb koncentrációval, ha a minta koncentrációja ismeretlen
	Sablon degradáció	A sablont újra elkészítettük, és a kísérletet megismételtük
	A rendszerben PCR-gátlók vannak	Általában a templátot bevisszük, a templát hígítási arányát növeljük, vagy a nagy tisztaságú templátot újrakészítjük és megismételjük.
	Az alapozók lebomolhatnak	A hosszabb ideig nem használt primerek integritását először PAGE elektroforézissel kell ellenőrizni, hogy kizárják a lebomlás lehetőségét.
	Alacsony erősítési hatásfok	Növelje a primer koncentrációját, próbáljon ki egy háromlépéses amplifikációs eljárást, vagy tervezze újra a primert
	Az erősítő termék túl hosszú	Az amplifikációs termék hosszát 80-300 bp tartományban szabályoztuk
Az üres vezérlő mutatja a jelet	A reakciórendszer szennyezése	Először is ki kell cserélni az üres kontrollvizet. Ha ugyanaz a helyzet továbbra is fennáll, a primereket, az aspirátorokat és a PCR csöveket ki kell cserélni, vagy új Master Mixet kell indítani. A reakciórendszert szupertiszta asztalon készítik el az aeroszolszennyezés csökkentése érdekében
	Nem specifikus amplifikáció, például primer dimerek jelennek meg	Általában normális, hogy az amplifikációs termékek 35 ciklus után megjelennek a vak kontrollban, amelyet az olvadásgörbével kell elemezni. Tervezze újra a primert, állítsa be a primer koncentrációját vagy optimalizálja a PCR reakcióeljárást
Az olvadási görbének több csúcsa van	Az alapozó kialakítása gyenge	Az új alapozót az alapozó tervezési elveinek megfelelően alakították át
	Az alapozó koncentrációja túl magas	Csökkentse megfelelően az alapozó koncentrációját
	A cDNS-templátban genomiális szennyeződés található	Az extrahált RNS-oldatot DNS-enzimekkel, például dsDNázzal emésztjük a genomiális szennyeződés eltávolítása vagy a transzintron primerek tervezése céljából.
A kísérletek rossz reprodukálhatósága	A minta hozzáadásának hibája nagy	Pontos pipetta használata, kiváló minőségű szívófejjel, pontos pipetta; Magas hígítású sablon, nagy térfogatú sablon hozzáadása a mintavételi hiba csökkentése érdekében; A qPCR reakciótérfogata megnőtt
	A sablonkoncentráció túl alacsony	Ismételje meg a kísérletet a sablon hígítási idejének csökkentése érdekében
	Hőmérséklet-eltérés a qPCR műszer különböző helyein	Rendszeresen kalibrálja a qPCR műszert
Az erősítési görbe nem sima	A fluoreszcencia jel túl gyenge, rendszerkorrekció után keletkezik	Győződjön meg arról, hogy a Master Mixben előkevert színezékek nem bomlanak le; Cserélje ki a fluoreszcens jelet a jobb qPCR kellékek összegyűjtéséhez
Az erősítési görbe megtörik vagy elcsúszik	A templátkoncentráció magasabb volt, és az alapvonal végpontértéke nagyobb volt, mint a CT-érték	Az alapvonal végpontját (Ct-érték -3) csökkentették, és az adatokat újra elemezték
Az egyes Wells amplifikációs görbéi hirtelen meredeken estek	Buborékok vannak a reakciócsőben	Győződjön meg arról, hogy a MIX teljesen feloldódott, és ne örvényljön és ne rezegjen egyenletesen; A minta hozzáadása után a buborékokat könnyű elasztikus centrifugálással eltávolítjuk. Az elődenaturálási időt 10 percre meghosszabbítottuk a buborékok eltávolítására

 

Csak kutatási célra!

 

 

Népszerű tags: 2 × gyors sybr zöld qpcr master mix (low rox), Kína 2 × gyors sybr green qpcr master mix (low rox) gyártók, beszállítók, gyár